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Chat S2000 à haut débit

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Chat S2000 à haut débitheters (Medikit Corporation, Tokyo, Japon) ont été utilisés pour établir une occlusion veineuse pulmonaire totale chez tous les chiens. Dans le groupe PVL total, la veine jugulaire gauche a été ponctionnée sous anesthésie générale, et un fil de guidage en acier inoxydable de 0,018 pouce a été avancé dans l'oreillette gauche et avancé dans la veine cave supérieure, puis dans l'oreillette droite. Après la mise en place du fil guide, un fil guide J-tip (Medikit Corporation) a été avancé à travers l'oreillette gauche jusqu'à la veine cave supérieure gauche pour atteindre l'oreillette droite. Un cathéter veineux pulmonaire à double lumière de 8 Fr (Biolight Inc., Taipei, Taiwan) a ensuite été avancé sur le fil de guidage, de l'oreillette droite à l'oreillette gauche et dans la veine pulmonaire du côté droit. La veine jugulaire droite a été ponctionnée pour injection intraveineuse de produit de contraste. Une seringue de 1 ml (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) avec une aiguille de 25 ga a été connectée au cathéter veineux pulmonaire à double lumière. Après injection du produit de contraste (Visipaque, 320 mg I/ml, Iopamiro 300, Amersham Pharmacia, Tokyo, Japon) dans la lumière auriculaire droite et la lumière auriculaire gauche, un fil-guide J-tip de 0,018 pouce (Medikit Corporation) a été avancé à travers la lumière auriculaire à la veine pulmonaire. Un piège Amplatz GooseNeck de 2,3 Fr (Boston Scientific, Natick, MA, États-Unis) a été utilisé pour fermer la veine pulmonaire pendant 1 min, et un fil-guide J-tip de 0,018 pouce (Medikit Corporation) a été réavancé dans la lumière auriculaire. Après fermeture, le ballon d'occlusion veineuse pulmonaire a été gonflé avec 10 ml de solution saline héparinée (10 000 UI/ml).

Le cathéter veineux pulmonaire a été réavancé dans l'oreillette droite et dans l'oreillette gauche pour recueillir du sang supplémentaire de circulation extracorporelle (400 ml au total). Après que le cathéter veineux pulmonaire ait été réavancé dans l'oreillette gauche, le circuit de circulation extracorporelle a été démarré. Le cathéter veineux pulmonaire a été réavancé dans l'oreillette droite pour recueillir un autre 400 ml de sang pour le sang supplémentaire de circulation extracorporelle.

Une sternotomie médiane a été réalisée pour exposer le cœur, et le péricarde a été ouvert pour exposer tout le cœur. L'oreillette gauche a été ouverte pour drainer 600 ml de sang. Une éponge imbibée de sang a été placée dans l'oreillette gauche pour faciliter l'identification et la manipulation des veines pulmonaires. Les veines pulmonaires ont été isolées et divisées en deux dans le sens de la longueur. Les veines pulmonaires gauche et droite ont toutes deux été obstruées à l'aide du collet Amplatz GooseNeck. Après la fermeture des premières veines pulmonaires, le collet a été repositionné sur les veines pulmonaires restantes, et trois veines pulmonaires supplémentaires ont été obstruées. De plus, trois veines pulmonaires qui n'étaient pas initialement ligaturées ont été ligaturées. Chaque veine pulmonaire a été ligaturée en utilisant une suture en bourse de soie 4--0 (Ethicon, Inc, Somerville, NJ) pour s'assurer qu'aucune veine pulmonaire n'est restée perméable. La veine pulmonaire supérieure a été disséquée de la veine pulmonaire moyenne et ligaturée. La veine pulmonaire inférieure a été disséquée de l'appendice auriculaire gauche, ligaturée et divisée en deux. L'appendice auriculaire gauche a ensuite été disséqué de la paroi auriculaire gauche et ligaturé. La veine pulmonaire inférieure était sectionnée à la jonction supéro-inférieure. La veine pulmonaire supérieure était sectionnée à la jonction gauche-droite. La veine pulmonaire moyenne a été divisée et divisée à nouveau, à gauche de la veine pulmonaire moyenne, en trois morceaux égaux. La veine pulmonaire supéro-latérale a été ligaturée. Les veines pulmonaires antérieure et postérieure ont également été ligaturées. Les dernières veines pulmonaires ligaturées étaient reliées dos à dos par une suture continue. Le flux veineux pulmonaire antérograde était dirigé loin du cœur. Le cœur a été repositionné dans le sternum et la poitrine a été fermée en couches.

Histologie et immunohistochimie {#s2.4}

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Pour évaluer le degré d'autophagie dans le tissu pulmonaire, des coupes incluses en paraffine ont été déparaffinées et l'autophagie a été détectée avec un anticorps Beclin 1 (1:100, Abcam, USA) et un test d'immunohistochimie (IHC) a été effectué. Les coupes de tissu pulmonaire incluses en paraffine ont été déparaffinées dans du xylène et réhydratées avec une solution d'éthanol gradué. Les coupes ont ensuite été placées dans une solution bouillante de récupération d'antigène (tampon citrate 10 mM, pH 6,0) puis traitées pour la récupération d'antigène. Ensuite, les coupes ont été rincées dans une solution saline tamponnée tris avec du Tween-20 (TBST) et traitées avec une solution à 3 % de H~2~O~2~ pendant 30 min. Les coupes ont ensuite été rincées dans du TBST et incubées avec du sérum de chèvre pendant 1 h. Après lavage avec du TBST, les coupes ont été incubées avec l'anticorps Beclin 1 (1:100) à 4°C pendant une nuit. Le jour suivant, les coupes ont été lavées avec du TBST, puis incubées avec un anticorps IgG de lapin marqué à la peroxydase de raifort (HRP). Pour visualiser les cellules marquées par des anticorps, les sections ont été visualisées avec une solution de chromogène de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (0,05 % de DAB, 0,01 % de H~2~O~2~) et contre-colorées avec de l'hématoxyline. Les sections ont été montées et analysées par un pathologiste expert qui était aveugle aux groupes expérimentaux. L'intensité de coloration a été classée comme suit : 0 = aucune coloration, 1 = faible, 2 = intermédiaire, 3 = forte. Le pourcentage moyen de coloration a été déterminé à l'aide du logiciel d'analyse d'images Image-Pro Plus 6.0.

Western blot

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Les tissus pulmonaires ont été pulvérisés dans de l'azote liquide. Les poudres de tissu pulmonaire ont été dissoutes dans un tampon de lyse d'essai de radio-immunoprécipitation (RIPA). Des quantités égales de protéines (50 mg) ont été soumises à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 12 % (SDS-PAGE). Ensuite, la protéine a été transférée sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Après incubation avec 5% de lait écrémé pendant 1 h, la membrane a été incubée avec l'anticorps Beclin 1 (1:1 000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), l'anticorps anti-LC3 (1:1 000, Cell Signaling Technology), l'anti -anticorps p62 (1:1 000, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) ou GAPDH (1:1 000, Cell Signaling Technology) à 4°C pendant la nuit. Ensuite, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire IgG anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1:1 000, Cell Signaling Technology) pendant 1 h. Les bandes de protéines ont été détectées à l'aide du substrat Immobilon Western Chemiluminescent HRP (EMD Millipore, Billerica, MA, USA).

analyses statistiques

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L'analyse statistique a été réalisée en utilisant SPSS 20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Les comparaisons entre les groupes ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur